Cobre 02: Estudio 01: test de bacterias: la olla de cobre desinfecta el agua

Traducción de: Storing Drinking-water in Copper pots Kills Contaminating Diarrhoeagenic Bacteria

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3312355/

National Center for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medicine 8600 Rockville Pike, Bethesda MD, 20894 USA
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V.B. Preethi Sudha,¹ Sheeba Ganesan,¹ G.P. Pazhani,² T. Ramamurthy,² G.B. Nair,² und Padma Venkatasubramanian¹

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Resumen

En la mayoría de los países en desarrollo, el agua está contaminada con microbios y es un problema importante. El tratamiento del agua es caro, especialmente en el campo. Ayurveda recomienda mantener el agua potable en recipientes de cobre. El estudio fue diseñado para evaluar el efecto de los recipientes de cobre en el agua potable contaminada. Las muestras de agua también se enriquecieron con importantes bacterias diarreicas, como el cólera (Vibrio cholerae O1, Shigella flexneri 2a, Escherichia coli enterotoxigénica, E. coli enteropatógena, Salmonella enterica Typhi y Salmonella Paratyphi).

Las ollas de cobre eliminan las bacterias

Cuando el agua potable (pH 7,83 ± 0,4; fuente: de la tierra) se contaminó con 500 UFC / ml de las bacterias anteriores y se almacenó en ollas de cobre durante 16 horas a temperatura ambiente, no se pudieron recuperar bacterias en el medio de cultivo. Después de eso, el agua ya no pudo estar contaminada y se perdió la capacidad de cultivo. Este es el primer informe sobre los efectos del cobre en S. flexneri 2a, E. coli enteropatógena y Salmonella paratyphi.

Las ollas de cobre elevan el pH del agua

Después de 16 horas, el pH del agua en las ollas de cobre se elevó ligeramente de 7.83 a 7.93, mientras que los demás parámetros físico-químicos permanecieron sin cambios. El contenido de cobre (177 ± 16 ppb) en el agua almacenada en ollas de cobre estaba dentro de los límites permitidos por la Organización Mundial de la Salud.

Ollas de cobre para países en desarrollo

El cobre es una solución prometedora para la purificación microbiana del agua potable, especialmente en los países en desarrollo.

El texto completo del informe del estudio (traducción)

[Detalles]: Introducción

El suministro de agua potable para los países menos desarrollados sigue siendo un problema grande. Más o menos un millar de personas no tienen acceso a agua potable limpio (1). Es contaminado con bacterias, virus, y protozoos, tb. la comida, eso provoca diarrea infecciosa. Diarrea es una de las causas principales de la mortalidad y morbididad sobre todo con niños de los países no tan desarrollados (2) y salen cada año 2 millones de víctimas muertas (3). Los patógenos etiológicos más importantes que causan más de un millón de muertes por diarrea, especialmente en los países en desarrollo, son Escherichia coli enterotoxigénica (ETEC), rotavirus, Vibrio cholerae y especies de Shigella, que se transmiten a través del agua y los alimentos contaminados o de persona a persona (4). En la India, todavía se producen brotes de cólera en muchos estados. Entre 1996 y 2007, al menos 222.038 personas se vieron afectadas por el cólera (5). La shigelosis, también conocida como disentería bacilar aguda, se asocia con complicaciones, como el síndrome urémico hemolítico, que puede ser fatal (6). Shigella flexneri causa aproximadamente el 10% de todas las enfermedades diarreicas en niños menores de cinco años (7). La infección por ETEC está relacionada con la diarrea del viajero, y la tasa de infección es más alta en la India en comparación con otros países en desarrollo (8). Entre los virus, los rotavirus son la principal causa de diarrea en bebés y niños. En Asia, los rotavirus son responsables del 45% de los ingresos hospitalarios por diarrea infantil grave (9).

La calidad microbiana es solo uno de los parámetros para el agua potable, pero es un problema importante y una causa de epidemias en los países en desarrollo. Las intervenciones comunitarias existentes para proporcionar a las personas agua potable segura tienen muchas deficiencias, y los estudios han demostrado que las intervenciones domiciliarias en el punto de uso (PoU) ayudan a reducir la diarrea en un 30-40% (10). Además, en países como India, donde solo el 28% de los hogares tiene agua del grifo (5), las intervenciones de PoU son una forma sostenible de proporcionar agua potable.

Textos de Ayurveda como almacenar el agua en vasos de cobre

El almacenamiento de agua en vasijas de cobre y plata se menciona en los textos antiguos de Ayurveda para purificar el agua (11). Nuestro estudio anterior proporcionó evidencia de laboratorio de la actividad antibacteriana de las ollas de cobre en agua destilada (12). También informamos sobre el beneficio de usar un dispositivo a base de cobre que inventamos que era tan efectivo como la olla pero a una fracción del costo (12). El agua destilada es ligeramente ácida (pH 6,7 ± 0,05), lo que podría mejorar la lixiviación del cobre. El estudio aquí trata sobre el agua potable normal (pH 7,83 ± 0,4) en recipientes de cobre y el efecto sobre las bacterias de la diarrea.

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MATERIALES Y MÉTODOS

Cepas bacterianas

El Instituto Nacional (National Institute) envió varios virus como: V. cholerae O1 IDH 02474 (VC), S. flexneri tipo 2a IDH 02196 (SF), Salmonella enterica Typhi 500865 (SET) y E. coli enterotoxigénica (LT + ST) IDH 01254 (ETEC), también virus del cólera y enfermedades entéricas (NICED), Kolkata, India. S. Paratyphi A B / 05 (SPT) fue adquirido de St. John's Medical College en Bangalore, India y validado por NICED. E. coli enteropatógena E 2347 (EPEC) provino de la universidad medicinal Christian (Christian Medical College - CMC), de la ciudad Vellore en India.

Producción de cultivos bacterianos

Los cultivos de la barra de cultivo de agar nutritivo se sembraron en medios selectivos, incluido el medio de agar eosina azul de metileno (EMB) (HIMEDIA, Mumbai, India) para las especies de E. coli, medio xilosa lisina dextrosa (XLD) (HIMEDIA) para especies de Salmonella, medio de agar entérico Henktoen (HEA) (Difco, EE. UU.) para Shigella y medio de tiosulfato-citrato-sal biliar-sacarosa (TCBS) (HIMEDIA) para V. cholerae y fueron de 16 a 18 horas a 37 ° C incubado en una incubadora de bacteriólogos (IN 18 DF, Servewell Instruments Private Limited, Bangalore, India). Después de la incubación, se seleccionó una sola colonia y se inoculó en 2 ml de caldo Luria Bertani (Difco) y se incubó durante 16-18 horas en una incubadora bacteriológica a 37 ° C. Este cultivo de una noche se diluyó en serie en solución salina normal (NaCl, 0,85%) para la inoculación en agua.

Actividad antibacteriana de la olla de cobre en agua potable inoculada con patógenos entéricos

El siguiente procedimiento experimental fue esencialmente el mismo que el de Sudha et al. (12). Las ollas de cobre con una capacidad de 2 L (test) fueron compradas de proveedores locales. Cada vez antes de su uso fueron limpiados minuciosamente y autoclavizados. Como control sirvió botellas de vidrio de 1 litro (Schott Duran, Mainz, Alemania).

En Bangalore, el agua se recogió del grifo (agua subterránea, bombeada al tanque sobre el agua) del departamento de microbiología de la FRLHT (Fundación para la revitalización de las tradiciones locales de salud), fue recolectado y autoclavizado. El agua esterilizada se inoculó con un cultivo nocturno diluido en serie de las bacterias diarreogénicas en ~ 500 Unidades de cultivo de colonias (UFC) / ml. Lo mismo se enumeró mediante un método de placa extendida en agar nutritivo (HIMEDIA). Se vertieron dos litros de agua inoculada en ollas de cobre (2 x 2 L) y un litro en cada una de las dos botellas Schott Duran preesterilizadas. Después de 16 horas de incubación a temperatura ambiente (26 ± 2 ° C), se añadieron 100 µl después de mezclar. Se toman muestras de cada recipiente y se siembran en agar nutritivo para el recuento bacteriano. La reanimación de las células dañadas subletalmente se controló mediante un método de enriquecimiento (13). Se mezclaron tres ml de muestra de agua de prueba o de control con un volumen igual de agua con peptona de doble concentración (medio de enriquecimiento) y se incubaron durante 24 horas a 37 ° C. Después de la incubación, se observó la turbidez del medio y también se sembró en estrías un bucle del cultivo enriquecido en el medio selectivo respectivo como se mencionó anteriormente y se observó el crecimiento después de la incubación a 37ºC durante 24 horas. Todos los experimentos se realizaron tres veces, cada vez manteniendo duplicados.

Análisis físico-químico del agua.

Se realizaron pruebas y controles del agua inoculada antes y después de la vacunación para determinar las propiedades físico-químicas como el valor de pH, turbidez, sólidos disueltos totales (TDS), alcalinidad, dureza, contenido de cloruros y sulfatos de acuerdo con los protocolos de la Oficina de Normas de la India (14). El valor de pH se midió usando un medidor de pH (DI 707; Digisun Electronics, Hyderabad, India). El contenido de cobre se determinó usando Spectroquant (Merck, Darmstadt, Alemania), un kit listo para usar disponible comercialmente como se describe en Sudha et al. (12).

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RESULTADOS

Actividad antibacteriana de la olla de cobre en agua potable inoculada con patógenos entéricos

[Ollas de cobre]: Bacterias VC, SF, ETEC, EPEC, SET y SPT inoculados en agua no pudieron obtenerse en el medio de crecimiento específico, como se menciona en los procedimientos (tabla 1). En las botellas de vidrio de control, sin embargo, el número de bacterias inoculadas permaneció igual o aumentó ligeramente (tabla 1). [En las ollas de cobre] después de la vacunación en el caldo de enriquecimiento, no hubo turbidez visible en las muestras de prueba y no se pudieron recuperar bacterias cuando los cultivos enriquecidos se esparcieron en medios selectivos. En los controles [en las botellas de vidrio], se observó una turbidez del medio de enriquecimiento y un posterior crecimiento de bacterias en un medio selectivo (tabla 1), y las características son: VC tiene un color amarrillo en medio TCBS, SF tiene un color verde en el medio HEA, y especies de Salmonella tienen un color rosado con o sin centro negro en el medio XLD, mientras que ETEC y EPEC tienen color brillo metálico en medio de agar EMB. Esto indica que [en las ollas de cobre] las bacterias en las muestras de prueba estaban completamente muertas o habían perdido su capacidad de cultivo en el medio.

Tabla 1

Almacenamiento de agua del grifo inoculada durante la noche: comparación de ollas de cobre - botella de vidrio

Bacterias inoculadas	Posición antes de la vacunación Dosis en CFU/mL	Ollas de cobre después de la vacunación Medición bacteriana en CFU / mL	Ollas de cobre después de la vacunación, crecimiento en cultivo bacteriano.	Botellas de vidrio después de la vacunación Medición bacteriana en CFU / mL	Botellas de vidrio después de la inoculación, crecimiento de cultivo bacteriano.
V. cholerae O1 IDH 2474	506±11	no crecimiento	no constatado	516±11	constatado
S. flexneri 2a IDH 02196	533±28	no crecimiento	no constatado	530±26	constatado
ETEC IDH 01254	513±23	no crecimiento	no constatado	866±83	constatado
EPEC E2347	506±11	no crecimiento	no constatado	600±10	constatado
S. enterica Typhi 500865	170±53	no crecimiento	no constatado	109±66	constatado
S. Paratyphi A	453±109	no crecimiento	no constatado	361±67	constatado

tabla original (en inglés)

CFU=Colony-forming unit (unidad de la formación de colonias);

EPEC=Enteropathogenischer Escherichia coli;

ETEC=Enterotoxigenischer Escherichia coli

Parámetros físicos y químicos

El contenido de cobre que se había disuelto en las muestras de prueba era de 177 ± 16 ppb, que se encontraba dentro del límite de la OMS de 2000 ppb (Tabla 2). El TDS, la alcalinidad, la dureza, el contenido de cloruros y sulfatos permanecieron iguales antes y después de la incubación en las muestras de prueba y control, excepto que el valor de pH en las muestras de prueba (recipiente de cobre) después de la incubación fue ligeramente subiendo de 7.83 ± 0.4 a 7,93 ± 0,3 durante 16 horas (Table 2).

Tabla 2

Calidad fisicoquímica del agua del grifo antes y después de la vacunación en la olla de cobre y en botellas de vidrio.

Parámetro	*Valor límite permitido (BIS/OMS)**	Antes de la vacunación	Después de la vacunación	Después del control de vacunación
Alcalinidad (mg / l)	600	25	25	25
Dureza (mg / L)	600	280	280	280
Turbidez (NTU)	10	0.47	0.47	0.47
TDS (mg/L)	2,000	700±49.5	655±35.4	690±14
Cloruros (mg / L)	1,000	35.45	35.45	35.45
Sulfatos (mg / L)	400	86.5	86.5	86.5
pH	8.5-9.0	7.83±0.4	7.93±0.3	7.83±0.4
Contenido de cobre (mg / L) *	2	<DL 0.1	0.177±0.016	<DL

*Grenzwert gültig beim Test=0.02 mg/L;

BIS=Bureau of Indian Standards (Oficina de valores de límites en India);

DL=Detecting limit (límite que vale durante el test);

NTU=Nephelometric turbidity unit (Unidad de opacidad);

TDS=Total dissolved solids (TDS = Cantidad total de sólidos disueltos);

WHO=World Health Organization (OMS="Organización Mundial de Salud")

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DISCUSIÓN

En el agua almacenado en vasos de cobre no se pudo encontrar patógenos, ni después de otra vacunación adicional. Este es el primer informe de la actividad antibacteriana del cobre contra cepas patógenas de SF, EPEC y SPT. La olla de cobre es tan activa con agua potable normal (pH 7,83 ± 0,4) como la que usamos antes (12) con agua destilada (pH 6,7 ± 0,05). Se disuelve menos cobre (177 ±) 16 ppb) en agua potable normal [alcalina] que en agua destilada [ácida] (~ 420 ppb).

Otros estudios han demostrado que, dependiendo de las condiciones de pH y temperatura, el agua de cobre en los recipientes de cobre es fatal para E. coli, y la inactivación más rápida ocurre cuando el pH aumenta por encima de pH 7 (neutral) y la temperatura cae por debajo de 35 ° C (15) . También se ha demostrado que el cobre tiene efectos más o menos fuertes sobre E. coli incluso en presencia de componentes orgánicos e inorgánicos en el agua (16). En experimentos de laboratorio, se ha demostrado que el cobre mata Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (17), Campylobacter jejuni y S. enterica (18). Los resultados de estos estudios sugieren que el cobre puede actuar sobre varios organismos en diferentes condiciones. También es importante probar el efecto del cobre en diferentes fuentes de agua potable en diferentes condiciones de campo. La seguridad del cobre lixiviado en el agua no parece ser un problema, ya que los estudios han demostrado que la pauta actual de la OMS de 2 mg Cu / L es segura (19,20) y los niveles extraídos en el estudio fueron 1/20 de los valores límite permisibles. En el presente estudio se observó que los demás parámetros fisicoquímicos del agua potable permanecen sin cambios después de las intervenciones con cobre, por lo que este método es generalmente posible.

Fue posible de observar que bacterias no detectados más en las pruebas de test no fueron posible de revivir cuando fueron distribuidos en suelos selectivos. Eso es una señal que han perdido la capacidad de ser cultivable en medio no selectivo y en medio de enriquecimiento. Pero tenemos que confirmar si viven todavía pero se han convertido en un estado no cultivable (VBNC). VBNC es un estado de vida en bacterias donde las celulas no crecen en medios pero todavía viven (21). Bacterias de VBNC fueron investigados aplicando diversos métodos también cambiando temperaturas (22), aplicando medios de enriquecimiento (23), cambios del medio de crecimiento, usando un saco embrionario de pollo, a través de un asa ileal de conejo (13) o co-cultivación con cultivos de células eucariotas (21). Se observaron bacterias VBNC mediante tinciones viables (22) y microscopía (21,24,25) .

Superficies de cobre matan todo rápido

El cobre destruye la E. coli

Los estudios han demostrado que las superficies de cobre matan las bacterias por completo. Las E. coli vacunadas en cupones de cobre se destruyeron por completo.

El cobre causa daño en la membrana de las bacterias

Los estudios concluyeron que los iones de cobre causaron una muerte completa de las bacterias a través del daño de la membrana (26). Sin embargo, el mecanismo de acción del cobre sobre las bacterias no se comprende completamente.

Superficies de cobre en hospitales + clínicas: tratamiento de agua potable en una olla de cobre (por ejemplo, en la India)

Aunque los estudios han demostrado que las superficies de cobre son útiles para mejorar la higiene pública en las instalaciones de atención de la salud, los usos potenciales del cobre para purificar el agua potable, especialmente en los países de menos desarrollo, no se han estudiado ampliamente. Por lo tanto, los resultados de nuestro estudio muestran que el cobre tiene el potencial de abastecer a las masas rurales de los países en desarrollo con agua potable microbianamente segura.

El uso de ollas de cobre en los hogares indios está muy extendido y, por lo tanto, es probable que la gente lo acepte socialmente. Su función no depende de combustible, electricidad, filtros reemplazables, intensidad de la luz solar, etc. para operarlo o mantenerlo. Es simplemente un almacenamiento pasivo de agua. Esto tiene en cuenta las condiciones en las aldeas rurales y los barrios marginales urbanos de los países en desarrollo. Los beneficios para la salud que se pueden obtener al usar una olla de cobre como purificador de agua PoU superan mucho el costo de la olla partiendo el costo a todos los miembros de una familia rural, especialmente porque es una inversión única sin costo recurrente. Sin embargo, es importante cuestionar su uso en el mundo real considerando la dinámica de los hogares y así se entiende las limitaciones.

[Quiere decir: Cuando ninguno cae enfermo más usando ollas de cobre, se puede limitarse a la familia de 3 niños y usar anticonceptivos].

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Acción de gracias

El estudio fue apoyado por el programa ETC CAPTURED en los Países Bajos (Beca No. DGIS / D). Los autores agradecen al Sr. Darshan Shankar, asesor de la IAIM, por su constante apoyo.

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Fuentes

1. World Health Organization . Progress on sanitation and drinking-water: 2010 update. Geneva: World Health Organization; 2010. p. 55. (WHO/UNICEF 2010) [Google Scholar]

2. Kosek M, Bern C, Guerrant RL. The global burden of diarrhoeal disease, as estimated from studies published between 1992 and 2000. Bull World Health Organ. 2003;81:197–204. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

3. Fontaine O, Kosek M, Bhatnagar S, Boschi-Pinto C, Chan KY, Duggan C, et al. Setting research priorities to reduce global mortality from childhood diarrhoea by 2015. PLOS Med. 2009;6:e41. (doI:10.1371/Journal.Pmed.10000412) [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

4. Qadri F, Svennerholm AM, Faruque ASG, Sack RB. Enterotoxigenic Escherichia coli in developing countries: epidemiology, microbiology, clinical features, treatment, and prevention. Clin Microbiol Rev. 2005;18:465–83. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

5. Kanugo S, Sah BK, Lopez Al, Sung JS, Paisly AM, Sur D, et al. Cholera in India: an analysis of reports, 1997-2006. Bull World Health Organ. 2010;88:185–91. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

6. Sur D, Ramamurthy T, Deen J, Bhattacharya SK. Shigellosis: challenges & management issues. Indian J Med Res. 2004;120:454–62. [PubMed] [Google Scholar]

7. Niyogi SK. Shigellosis. J Microbiol. 2005;43:133–43. [PubMed] [Google Scholar]

8. Shah N, Dupont HL, Ramsey JD. Global etiology of travelers’ diarrhea: systematic review from 1973 to the present. Am J Trop Med Hyg. 2009;80:609–14. [PubMed] [Google Scholar]

9. Grimwood K, Lambert SB. Rotavirus vaccines: opportunities and challenges. Hum Vaccines. 2009;5:57–69. [PubMed] [Google Scholar]

10. Sobsey MD, Stauber CE, Casanova LM, Brown JM, Elliott MA. Point of use household drinking water filtration: a practical, effective solution for providing sustained access to safe drinking water in the developing world. Environ Sci Technol. 2008;42:4261–7. [PubMed] [Google Scholar]

11. Sharma PV, Susruta Samhita V. 1. Sutra Sthana 45, 246 verse 13. Varanasi: Chaukamba Visva Bharati; 2004. p. 418. [Google Scholar]

12. Sudha VBP, Singh KO, Prasad SR, Venkatasubramanian P. Killing of enteric bacteria in drinking water by a copper device for use in the home: laboratory evidence. Trans R Soc Trop Med Hyg. 2009;103:819–22. [PubMed] [Google Scholar]

13. Oliver JD. Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria. FEMS Microbiol Rev. 2009;34:1–11. [PubMed] [Google Scholar]

14. Bureau of Indian Standards . Methods of sampling and test (physical and chemical) for water and waste-waster: IS:3025-1983 (part 5) reaffirmed 2002. New Delhi: Bureau of Indian Standards; 2002. [Google Scholar]

15. Sharan R, Chhibber S, Attri S, Reed RH. Inactivation and injury of Escherichia coli in a copper water storage vessel: effects of temperature and pH. Antonie Van Leeuwenhoek. 2010;97:91–7. [PubMed] [Google Scholar]

16. Sharan R, Chhibber S, Attri S, Reed RH. Inactivation and sub-lethal injury of Escherichia coli in a copper water storage vessel: effect of inorganic and organic constituents. Antonie Van Leeuwenhoek. 2010;98:103–15. [PubMed] [Google Scholar]

17. Noyce JO, Michels H, Keevil CW. Potential use of copper surfaces to reduce survival of meticillin-resistant Staphylococcus aureus in the healthcare environment. J Hosp Inf. 2006;63:289–97. [PubMed] [Google Scholar]

18. Faúndez G, Troncoso M, Navarrete P, Figueroa G. Antimicrobial activity of copper surfaces against suspensions of Salmonella enterica and Campylobacter jejuni. BMC Microbiol. 2004;4:19. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

19. Pettersson R, Rasmussen F, Oskarsson A. Copper in drinking water: not a strong risk factor for diarrhoea among young children. A population-based study from Sweden. Acta Paediatr. 2003;92:473–80. [PubMed] [Google Scholar]

20. Araya M, Olivares M, Pizarro F, Llanos A, Figueroa G, Uauy R. Community-based randomized double-blind study of gastrointestinal effects and copper exposure in drinking water. Env Hea Pers. 2004;112:1068–73. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

21. Senoh M, Ghosh-Banerjee J, Ramamurthy T, Hamabata T, Kurakawa T, Takeda M, et al. Conversion of viable but nonculturable Vibrio cholerae to the culturable state by co-culture with eukaryotic cells. Microbiol Immunol. 2010;54:502–7. [PubMed] [Google Scholar]

22. Kell DB, Kaprelyants SA, Weichart DH, Harwood CR, Barer MR. Viability and activity in readily culturable bacteria: a review and discussion of the practical issues. Antonie Van Leeuwenhoek. 1998;73:169–87. [PubMed] [Google Scholar]

23. Ordax M, Marco-Noales E, Lo´Pez M, Biosca EG. Survival strategy of Eerwinia amylovora against copper: induction of the viable-but-nonculturable state. App Environ Microbiol. 2006;72:3482–8. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

24. Chaiyanan S, Chaiyanan S, Huq A, Maugel T, Colwell RR. Viablity of the nonculturable Vibrio cholerae O1 and O139. System Appl Microbiol. 2001;24:331–41. [PubMed] [Google Scholar]

25. Zhong L, Chen J, Zhang XH, Jiang YA. Entry of Vibrio cincinnatiensis into viable but nonculturable state and its resusucitation. Lett App Microbiol. 2009;48:247–52. [PubMed] [Google Scholar]

26. Espírito Santo C, Lam EW, Elowsky CG, Quaranta D, Domaille DW, Chang CJ, et al. Bacterial killing by dry metallic surfaces. App Environ Microbiol. 2011;77:794–802. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

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